Acta chirurgiae orthopaedicae et traumatologiae Cechoslovaca

Acta chirurgiae orthopaedicae et traumatologiae Cechoslovaca

Souborný referát / Current concepts review

ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAE ET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL.,
75, 2008, p. 247 - 252

Funkce růstových faktorů v lidském organismu a jejich využití v medicíně, zejména v ortopedii a traumatologii

The Role of Growth Factors in the Human Organism and Their Use in Medicine, Especially in Orthopedics and Traumatology

R. FREI1, F. E. BIOSCA2, M. HANDL1, T. TRČ1
1Klinika dětské a dospělé ortopedie a traumatologie 2. LF UK a FN Motol, Praha
2 Institut Nacional ďEducació Fisica de Catalunya (INEFC), University of Lleida, Spain
SUMMARY

The authors analyze one of the new therapeutic approaches - the use of autologous growth factors. Because the chemical structure of these proteins and their involvement in many functions of the organism affect the whole range of tissues, with a possibility to use them in human medicine. Growth factors, such as platelet-derived growth factor, transforming growth factor and others, exert effects on fibroplastic events during ontogenesis as well as on regeneration of tissues injured due to an accident or surgery. The preparation of therapeutic doses of growth factors consists of autologous blood collection, plasma separation and application of plasma rich in growth factors. The fibroplastic event insolves chemotaxis and proliferation of cells, proteosynthesis, reparation and remodeling of tissues.

The paper describes the method and is an introduction to studies on the utilization of growth factors in orthopaedics and traumatology.

Keywords: growth factor, PRGF, healing, reparation.

ÚVOD

Růstové faktory (Growth Factors, GF), specifické bílkovinné induktory buněčné proliferace, se v lidském organismu uplatňují jak v průběhu ontogeneze, tak v dospělosti, zejména při reparaci a regeneraci poškozených tkání (7, 10, 17, 21). Terapeutickým využitím těchto biopotentních proteinů se od 90. let 20. století intenzívně zabývá několik světových center (3, 22, 24). Zkušenosti experimentálních pracovišť s aplikací GF byly klinicky verifikovány nejprve v oblasti orofaciální chirurgie (2, 4, 9), nyní nastává postupné pronikání do většiny chirurgických oborů medicíny (26, 28, 29).

Historie terapeutického využití GF

ACHOT 4/2008

Počátkem 90. let minulého století, po objevení růstových faktorů a rozlišení jejich biologické aktivity (16, 17) na buněčné membráně i komplexně v živém organizmu (27), byly uskutečněny první pokusy s jejich terapeutickým využitím (23, 26, 30).

Optimalizace hojení, zrychlení reparace živočišných tkání a zlepšení vhojování bioadaptabilních implantátů, to byly požadavky, stojící na počátku rozsáhlých teoretických výzkumů a experimentálních aplikací GF (23, 26,31).

První kroky směřovaly k separaci a léčebné aplikaci adhezivních bílkovin plazmy (fibrinu, fibronektinu, vitronektinu), zejména fibrinu, který byl v potřebné terapeutické dávce získáván ze značného množství krve (450-500 ml) a aktivován použitím bovinního trombinu (pro humánní účely v Evropě nepovoleno).

Dr. Eduardo Anitua a dr. Mikel Sanchez ze španělské Vitorie zahájili etapu využití autologní plazmy, resp. Plasma Rich in Growth Factors (PRGF), nikoli pro samotný efekt fibrinu, ale pro biogenní účinek růstových faktorů, zejména trombocytárních proteinů, které mají klíčový význam v indukci buněčné proliferace (3). Příprava PRGF separované z relativně malého množství krve (40-120 ml) a terapeutická aplikace do místa leze dle exaktně stanovených a schválených doporučených postupů (TŮV 2003) otevřely kapitolu klinického použití v humánní medicíně.

MATERIÁL A METODIKA

Biochemické poznámky

ACHOT 4/2008

GF jsou proteiny syntetizované rozsáhlou skupinou buněk mezenchymálního původu, které se specificky váží nareceptory buněčných membrán zaúčelem indukce buněčné proliferace a/nebo diferenciace. Některé z růstových faktorů dokáží stimulovat množství odlišných buněčných typů, jiné jsou přísně specifické. Rozsáhlá skupina GF (tab. 1) obsahuje polypeptidy, které mají označení podle své funkce (resp. prvotně objevené funkce - například Fibroblast Growth Factor, FGF) a výskytu (místa jejich první derivace - například Platelet-Derived Growth Factor, PDGF). Tradiční pojmenování jednotlivých GF je ve světle novějších poznatků zavádějící, funkce i místa výskytu GF jsou černější (13, 14).

Výraznou podskupinu GF tvoří cytokiny, které jsou primárně secernovány leukocyty a stimulují humorální i buněčnou imunitní odpověď, stejně jako aktivují fagocytující buňky. Podle svého původu jsou rozděleny na monokiny a lymfokiny. Množství lymfokinů je známo jako interleukiny, které specificky působí jako GF pro většinu buněk hematopoetického původu (tab. 2) (27).

Většina GF je výrazně biopotentní, a to již při nano-molárních koncentracích. Mohou působit autokrinně, parakrinně i endokrinně.

V procesu regenerace pojivových tkání se nejvíce uplatňují polypeptidy primárně syntetizované megakaryocyty: Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Transforming Growth Factor 6-1 (TGF -1), Epidermal Growth Factor (EGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). V inaktivní formě se nacházejí v granulech trombocytů, ze kterých jsou uvolňovány například působením trombinu při hemostáze. Zahájení buněčné proliferace indukované GF trombocytů není závislé na množství krevních destiček a vyplavených GF neboť poměrné zastoupení jednotlivých antagonisticky působících GF (indukce proliferace - PDGF / inhibice - TGF 8-1) je konstantní (2.5-3/1), avšak rozsah a rychlost proliferace je v přímé úměře s počtem aktivních GF (3).

Stavba, funkce a mechanismus působení destičkových GF jsou vysvětleny na příkladu PDGF.

PDGF je produkován, kromě megakaryocytů, také dalšími buňkami například makrofágy, fibroblasty, endoteliálními buňkami, astrocyty, myoblasty i množstvím tumorózních buněk.

Expresí dvou odlišných genů 7p21-p22 a 22ql2.3-ql3 vznikají 2 základní řetězce aminokyselin - PDGF-A (PDGF-1) (16kDa, 124 aminokyselin) a PDGF-B (PDGF-2) (14kDa, 140 aminokyselin), které jsou identické pouze z 60 procent. Jejich kombinací a vazbou disulfidickými můstky vznikají biologicky aktivní homodimery PDGF-AA, PDGF-BB a heterodi-mer PDGF-AB. Dimery -BB, -AB jsou cirkulující izo-formy, zatímco -AA se nacházejí primárně v nestimu-lováných osteoblastech. Zastoupení jednotlivých dimerů v trombocytech je 70 : 20 : 10, -AB : -BB : -AA. Biologicky aktivnější jsou -BB, -AB, které se váží na buněčné membráně na receptory a i 6, zatímco -AA pouze na receptory a. Buněčné membrány PDGF-respondetních buněk (například fibroblastů, osteoblastů, chondroblastů, gliových i endoteliálních buněk) obsahují specifické PDGF receptory s hustotou exprese 40000-300000. Dosud byly popsány 2 typy PDGF receptorů, a to PDGFRa, který váže monomer PDGF-A a PDGF-B, a PDGFR6, který váže pouze PDGF-B. Receptory v dimerické podobě odpovídajícím způsobem váží izoformy PDGF - PDGF-AA pouze a-a, PDGF-AB a-a, i a-6, PDGF-BB a-a, a-6 i 6-6. Tvorba receptorů je usměrňována autoregulací GF Regulaci syntézy receptorů PDGF ovlivňuje TGF-6 a PDGF, ten ale ovlivňuje též nespecificky expresi receptorů IL1, EGF, transferinu, LDL, různé proteinázy apod. Funkční konsekvence heterogenity PDGF není zcela známa, dimerická forma převážně působí jako mitogen na buňky mesenchymálního původu, monomerická forma působí chemotakticky (27).

Navázáním dimeru na příslušný receptor dochází k fosforylaci karboxylové skupiny cytoplazmatické domény, a to nejméně ve dvou pozicích (Y751 a Y857). Mezi cytoplazmatickou doménou PDGF receptorů a několika dalšími proteiny (například phosphatidyl ino-sitol-3-kinázou (PI3), fosfolipázou C(PLC-gamma) a GTPázu-aktivujícím proteinem (GAP)) jsou vazby, které vznikají tyrosindependentní autofosforylací receptorů. Fosforylace v pozici Y751 je esenciální pro navázání PI3 na receptor, vazba GAP je podmíněna fosforylaci obou zakončení. Fosforylace receptorů indukuje intracelulární odpověď - proliferaci, proteosyntézu. Některé podněty transdukce zprostředkované PDGFRa a PDGFR6 jsou zcela jedinečné a nelze je substituovat.

Na rozdíl od většiny cytokinů, PDGF není volně cirkulující v krvi. Po intravenózním podání má aktivovaný PDGF biologický poločas kratší než 2 minuty. PDGF vázaný na plazmatické bílkoviny či proteiny extracelulární matrix působí jako autokrinní či parakrinní růstový faktor, v dospělosti se zejména uplatňuje pří hojení poraněných tkání.

Fyziologické aspekty tkáňové reparace

ACHOT 4/2008

Porušení tkáňové integrity vyvolává dynamickou kaskádu reparace tradičně rozdělovanou na fázi hemoragickou, fázi zánětlivou, fázi reparace a remodelace.

Na primární fázi hemoragickou navazuje lokální vazokonstrikce, je zahájena aktivace trombocytů s jejich degranulací a adhezí. Fáze hemoragická je ukončena hemostázou a chemotaxí zánětlivých buněk. Během zánětlivé fáze dochází k infiltraci neutrofily, makrofágy a lymfocyty, které produkují specifické cytokiny a fagocytózou čistí oblast leze. Proliferace buněk a syntéza kolagenu jsou součástí poslední fáze, která též zahrnuje remodelaci a reorganizaci. Na procesu hojení se podílejí minimálně dva signální systémy, rozpustný a nerozpustný. Mezi solubilní molekuly patří především polypeptidy růstových faktorů a inhibitorů, insolubilními faktory jsou adhezivní glykoproteiny a polypeptidy extracelulární matrix (laminin, fibronectin, kolagen) (16,21).

Trombocyty, krevní elementy, stavební prvky trombu pří hemostáze, mají též významnou roli jako nosiči řady důležitých proteinů. Tyto diskoidní části rozpadlých megakaryocytů, tvoří heterogenní skupinu (nejednotné velikosti, rozdílné hustoty). V krevním řečišti se nacházejí v počtu 150 000 - 400 000/ 1 a přežívají 8-10 dní. Kromě funkce pro-koagulační při tvorbě trombu přispívají k reparaci poškozených tkání uvolněním řady proteinů přímo v místě leze. Trombocyty přinášejí růstové faktory syntetizované megakaryocyty (PDGF, TGF 6-1, EGF, VEGF) i plazmatické bílkoviny (IGF-I, HGF), které získaly endocytózou během pobytu v krevním řečišti a řadu dalších proteinů uplatňujících se v komplexu koagulační kaskády (21). Při aktivaci trombocytů trombinem nastává přestavba jejich cytoskeletu a exocytóza denzních granul s ADP (adenosin-5'-difosfátem) a serotoninem, lisozomálních granul s degradačními enzymy a granul s GF.

Uvolněné GF zahajují chemotaxi, proliferaci mezenchymálních buněk i proteosyntézu. Úlohu jednotlivých GF v procesu reparace poškozených tkání ukazuje tabulka 3 (14). Na buněčné membráně se GF váží na příslušné receptory, dochází k fosforylaci cytoplazmatické domény receptorů GF a následné intracelulární aktivaci proliferace a proteosyntézy (angiogeneze, migrace fibroblastů, syntéza kolagenu). Hojení je ukončeno remodelaci - maturací a organizací jizvy.

Proces buněčné proliferace indukovaný GF je řízen intracelulární zpětnou vazbou. Pří zvýšeném počtu mitóz dochází k poklesu intracelulárního pH, při kterém se snižuje aktivita transkripce.

Aplikované GF taktéž zahajují chemotaxi, proliferaci, angioneogenezi, proteosyntézu, reparaci, remodelaci poškozené tkáně. Zvýšená koncentrace GF v poškozené tkáni navozená přímou aplikací PRGF (Plasma Rich in Growth Factors) do místa leze výrazně urychlí proces reparace a regenerace. Reparace augmentovaná PRGF má inflamatorickou fázi výrazně redukovánu, leukocyty a jejich cytokiny, interleukiny jsou v místě leze pouze v běžných, nenavýšených koncentracích. Porušená tkáň se hojí bez výrazného otoku a i bolestivost je snížena (méně nociceptivní aferentace). Antiedematózní účinek je přičítán rychlejší angiogenezi, slabé interendoteliální vazby se zvýšenou prostupností proteinů i erytrocytů do extracelulárního prostoru jsou proliferací endotelu rychle nahrazeny plnohodnotnou endoteliální výstelkou.

METODIKA

Charakteristika a technika přípravy PRGF

ACHOT 4/2008

PRGF je plazma s vysokým obsahem různých auto-logních proteinů, růstových faktorů. PRGF obsahuje GF trombocytů (PDGF, TGF -1, EGF, VEGF, IGF-I) i adhezivní plazmatické proteiny (fibrin, fibronektin, laminin).

Několik minut před plánovanou aplikací PRGF se odebere tenkou kanylou z periferní vény relativně malé množství krve (40 - 80 cm3), které odpovídá rozsahu terapeutického použití. Venózní krev se ve zkumavce smíchá s antikoagulanciem (0,5ml 3,8% citrátu sodného na 4,5 ml krve), které nemění morfologii destiček (EDTA - ethylendiamintetraoctová kyselina - poškodí trombocyty, ty jsou poté dysmorfní) ani neovlivňuje agregaci (ACD - kyselina citrónová, citrát sodný, dextróza - s pH 6,5 neumožní shlukování destiček).

Osmiminutová centrifugace při 1800 otáčkách za minutu oddělí plazmu od červené a bílé krevní řady, jednotlivé frakce plazmy mající odlišnou koncentraci GF jsou také proximodistálně uspořádány podle vzestupného gradientu. Příliš rychlá centrifugace způsobuje mechanické porušení trombocytů a jejich předčasnou aktivaci, pomalá neoddělí zcela exaktně všechny elementy bílé krevní řady (zvýšený obsah zánětlivých cytokinů v PRGF).

Největší koncentrace GF se nachází v plazmě, cca 0,5 cm3, těsně nad tenkou vrstvou leukocytů (3,4). Plazma s nejnižším obsahem GF zůstávající ve zkumavce nejproximálněji, cca 1 cm3, bohatá na fibrinogen, se využívá k přípravě fibrinového koagula (fibrinové zátky ran, ochranné bariéry). Jednotlivé frakce plazmy se pomalu separují pipetami, aby nedocházelo k mechanickému narušení trombocytů.

Před aplikací je třeba aktivovat trombocyty, aby započaly uvolňovat granula s GF (od aktivace bovinním trombinem bylo v tomto protokolu zcela upuštěno). Aktivace se provádí chloridem vápenatým (CaCl2) poskytujícím potřebný kationt Ca2+, který se účastní opakovaně v koagulační kaskádě. Dávkovaní musí být zcela exaktní, a to 50 |il CaCl2 na každý 1 cm3 PRGF, odlišný postup neumožní aktivaci trombocytů a exocytózu granul. Proces aktivace a zahájení tvorby koagula je ovlivňován také okolní teplotou, při 20 °C se koagulum začíná tvořit za 5-7 minut, při aplikaci a tělesné teplotě 37 °C je tvorba koagula zahájena do 3 minut.

Dvojmocný iont kalcia intervenuje v různých etapách koagulační kaskády, také transformace protrombinu na trombin je Ca2+ dependentní. Trombin, přeměnou fibrinogenu na fibrin, zahájí tvorbu fibrinové sítě, ke které adherují také krevní destičky - vzniká koagulum s aktivovanými trombocyty, které uvolňují GF do okolí.

Přímým použitím trombinu k aktivaci dochází k sekreci GF velice promptně (1-2 min), použitím Ca2+ se interval uvolňování GF prodlouží, 90-95 % GF se uvolní během první hodiny po aktivaci. Aplikace PRGF aktivovaná autologním trombinem se provádí okamžitě, při aktivaci Ca2+ do 5-10 min (2).

Aplikaci provádíme injekční infiltrací poškozené tkáně (můžeme aplikovat i perkutánně), převrstvením rány in vitro připraveným koagulem s GF a krytím fibrinovou zátkou, je-li třeba. Homo- i heterografty či implantáty také můžeme pokrýt na styčných plochách vrstvou koagula s GF a dále již implantovat obvyklým způsobem.

Použití PRGF

Primárně byly GF použity maxilofaciálními chirurgy při vyhojování alveolů po extrakci zubů (4, 5, 20). Kost byla připravována na implantaci dentálních implantátů. Vyhojení kostních defektů bylo výrazně rychlejší, komplikace se nevyskytovaly žádné. Následně se použití rozšířilo na veškeré stomatochirurgické zákroky.

Hranice použití GF nejsou přesně vymezeny, od semikonzervativní léčby při akutně vzniklé traumatické instabilitě hlezna perkutánní instalací PRGF do oblasti porušeného ligamenta fibulotalare anterior (11, 15,18,25), přes využití při osteosyntézách i primárních suturách ran (1, 6, 32), zlepšení hojení osteochondrálních defektů (19, 28, 29) až po augmentaci vhojování LCA graftu či aloplastik kloubů (22, 24). Taktéž hojení ulcus cruris, kožních defektů u pacientů s diabetes mellitus či jinak obtížně sanovaných dekubitů je úspěšné (8, 12, 23, 26, 30).

Indikační šíře použití PRGF je velmi rozsáhlá, terapeutický benefit pro pacienty široký: použití autologní-ho materiálu omezuje riziko nákazy (blood transfer disease), zkrácení doby hojení poškozených tkání (kratší expozice eventuálním patogenům při narušení funkce přirozených bariér), snížení bolestivosti, a sekundárně i efekt ekonomický zahrnující eliminaci množství farmak (antibiotik, antiinflamatorik, analgetik) a zkrácení pracovní neschopnosti.

ZÁVĚR

Využití růstových faktorů, autologních proteinů krevní plazmy, v procesu reparace tkání akutně poškozených či degenerativně změněných predikují výsledky již řady klinických studií v oblasti orofaciální medicíny, traumatologie, ortopedie a chirurgie.

Pro správné použití PRGF v léčbě je však třeba znát principy a dodržovat stanovené doporučené postupy. Jako každá nová terapeutická metoda podléhá i tato neustálému zkoumání v klinických studiích zaměřených na dlouhodobé výsledky jejího užití. Výzkum v oblasti biochemie, genetiky i imunologie časem pravděpodobně ještě upraví či zpřesní použití jednotlivých frakcí resp. proteinů PRGF.

V textu použité zkratky

ACD (Acidum Citricum - Dextrose (+ event, natrii citras) = kyselina citronová-dextróza (+ event, citrát sodný) - anti-koagulancium

ADP (adenosine-5'-diphosphate) = adenosin-5'-difosfát - nukleotid

APCs (Antigen Presenting Cells) = buňky prezentující antigen (monocyty, mikrofágy a další buňky)

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) = ethylendiamintetraoctová kyselina - antikoagulancium

EPO (Erythropoietin) = Erytropoetin - glykoprotein, hormon ovlivňující produkci erytrocytů

GAP (GTPase Activating Proteins) = GTPázu aktivující proteiny

GF (Growth Factor(s)) = růstový(é) faktor(y)

EGF- Epithelial Growth Factor (Epitelový růstový faktor)

FGF- Fibroblastic Growth Factor (Fibroblastový růstový faktor)

HGF - Hepatocyte Growth Factor (růstový faktor hepatocytů)

IGF- Insulin-like Growth Factor (Inzulínu podobný růstový faktor)

NGF- Nerve Growth Factor (Nervový růstový faktor)

PDGF - Platelet-derived growth factor (Destičkový růstový faktor)

TGF- Transforming Growth Factor (Transformující růstový faktor)

VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor (růstový faktor cévního endotelu)

GTP (Guanosine-5'-triphosphate) = guanosin-5'-trifosfát - purinový nukleotid

GTPáza = směs hydrolytických enzymů přeměňující GTP na GDP (guanosindifosfát) - při zahájení transdukce

IL= interleukiny - skupina cytokinů (tab.2) produkující signální molekuly

INF (Interferon) = interferon (tab. 4) - glykoprotein produkovaný zejména buňkami imunitního systému patří do skupiny cytokinů, asistuje v imunitní odpovědi jako inhibitor replikace viru v dalších buňkách lidského těla indukcí tvorby proteinů, které brání vniknutí virů do nitra buňky

LCA= ligamentum cruciatum anterius

LDL (Low-Density Lipoproteins) = lipoprotein s nízkou denzitou - závěrečné stadium VLDL (Very Low-Density Lipoprotein), který je produkován v játrech

MHC (Major Histocompatibility Komplex) = hlavní histokompatibilní komplex - komplex hrající významnou roli v imunitním systému, proteiny kódované MHC jsou vystaveny na povrchu buněk a prezentují části molekul mikrobů či dysfunkčních buněk (například tumorózních), tyto jsou rozpoznány T-lymfocyty, které mohou následně specificky mikroby, infikované či dysfunkční buňky zabíjet či koordinovat jejich likvidaci

MHC I. třídy - tyto molekuly jsou na všech buňkách lidského těla

MHC II. třídy - jsou pouze na specializovaných buňkách jako jsou makrofágy, dendritické buňky, aktivované T- a B-lymfocyty

NK (Natural Killer) = přirození zabíječi - buňky řazené do nespecifické imunity projevující se spontánní cytotoxickou reakcí (nemají klasický rozpoznávací receptor pro antigenní epitop jako T- či B-lymfocyty)

PDGFR (Platelet Derived Growth Factor Receptors) = receptory destičkového růstového faktoru - α a β

PI3 (Phosphatidyl Inositol-3-kinase) = fosfatidyl inositol-3-kináza - spolu s diacylglycerolem vzniká rozštěpením fosfatidylinositolu, jako sekundární posel reguluje prostupnost buněčné membrány

PLC (phospholipase C) = fosfolipáza C - klíčový enzym fosfatidylinositolovém metabolismu, hydrolýzou na buněčné membráně zahajuje její zprůchodnění pro proteiny

PRGF (Plasma Rich in Growth Factors) = plazma bohatá na růstové faktory T- lymfocyty (viz schéma 1) - zajišťují specifickou imunitu společně s B-lymfocyty, pomocnými buňkami imunity, cytokiny a komplementem Subpopulace - Tc (cytotoxické) - s koreceptorem T-CD8+

Th (helper - pomocné) - s koreceptorem T-CD4+
- podle produkce cytokinů

TNF (Tumor Necrosis Factor) = faktor působící nekrózu nádoru - TNF ? - kachektin, TNF ? lymfotoxin - hlavní mediator sepse a toxického šoku

TÜV (Technischer Überwachungs-Verein) = (Technical Monitoring Association) - organizace provádějící nezávislé testování strojů a postupů s cílem ochránit člověka a životní prostředí

Literatura
Celá stať v dokumentu PDF

Zpět


Nabídka nakladatelství:

 

Peter Wendsche, Radek Veselý et al.
Traumatologie

Traumatologie

Druhé, přepracované a rozšířené vydání

 

Jan Lebl, Zdeněk Šumník, Ondřej Souček, Hana Malcová, Klára Maratová, Jana Plešková, Štěpánka Průhová, Jan Štulík, Lukáš Wagenknecht
Onemocnění skeletu u dětí

Onemocnění skeletu u dětí

Motolské pediatrické semináře 4

 

Jiří Skála-Rosenbaum, Valér Džupa, Martin Krbec et al.
Zlomeniny proximálního femuru

Zlomeniny proximálního femuru

 

Jiří Kříž et al.
Poranění míchy

Poranění míchy

Příčiny, důsledky, organizace péče